تثبیت نیتروژن در گیاهان

زیست بوم - کشاورزی / عطیه کاظمی مجرد: با اينكه %٧٨ از حجم هواي اتمسفر را  N2 تشكيل مي‌دهد ، ولی این فرم از نیتروژن قابل استفاده برای گیاهان نمی باشد ، زیرا برای استفاده از N2    باید پیوند سه گانه بین اتم های نیتروژن را شکسته شده که این کار به طور مستقیم و به تنهایی توسط گیاهان امکان پذیر نیست . برای قابل استفاده شدنش  N2باید تثبیت شود. تثبيت نيتروژن يعني تبديل N2 گازي به فرم‌هاي نيترات ، آمونيوم و NH4.

انواع تثبیت نیتروژن
تثـبيت نيتروژن انواع مخـتلفي دارد. يكي از روش‌هاي تثبيت به روش صنعتي يا غير زيسـتي است كه در شرايط بـسيار خاص دماي بالا (oC200) و فشار بالا (atm 200)‏، N2 با H2 تركيب شده و آمونياك را مي‌دهد. به اين روش ، فرآيند هابر هم گفته مي‌شود.
فرم ديگري از تثبيت ،‏ تثبيت به روش‌هاي زيستي يا طبيعي است. كه خود به چند طريق صورت مي‌گيرد:

1. هنگام رعد و برق، راديكال‌هاي آزاد هيدروكسيل، اتم‌هاي آزاد هيدروژن، اتم‌هاي آزاد اكسيژن با نيتروژن مولكولي تركيب شده و توليد اسيد نيتريك مي‌کند. اين اسيد توسط آب باران به زمين مي‌رسد. به اين روش %١٠ از ازتي كه به روش طبيعي است ، تثبيت مي‌گردد.
2. بخش كوچكي از تثبيت ازت ناشي از واكنش‌هاي فتوشيميايي با دخالت اكسيدنيتريت گازي و ازن استراتوسفر است. اسيد نيتريك حاصل شده توسط آب باران به بخش‌هاي پايين‌تر جو مي‌رسد.
3. بخش عمده تثبيت به وسيله ميكروارگانيزم‌هاست. بعضي از ميكروارگانيزم با ايجاد يك رابطه همزيستي با ريشه گياه به تثبيت نيتروژن مي‌پردازند و برخي ديگر بدون همزيستي نيتروژن را تثبيت مي‌كنند.

تثبيت نيتروژن به روش غير‌همزيستي
میکروارگانیسم هایی كه نیتروژن را به صورت غير همزيست‏، تثبيت مي‌كنند شامل جلبک های سبزآبی و  انواع باکتری های هوازی ، بی هوازی و اختیاری می باشند .
سيانوباكتري‌ها يا جلبك‌هاي سبزآبي مثل Calothrix, Anabaena, Nostoc  می باشد . باكتري هایی كه به صورت آزاد نیتروژن را تثبيت مي كنند. شامل انواع هوازي مثل Derxia, Beijerinckia, Azotobacter. انواع اختياري مثل Klebsiella, Bacillus و همچنين انواع غيرهوازي شامل انواع فتوسنتز كننده و غير فتوسنتز كننده  می باشند .انواع فتوسنتزكننده مثل Chromatium, Rhodospirillum وانواع غيرفتوسنتزكننده مثل Clostridium, Methanococcus مي‌باشد (٧).

تثبيت نيتروژن به روش همزيستی
باكـتـري‌هـايي كه نیـتـروژن را بـه روش هـمـزيـسـت تثـبـيـت مي‌كـنـنـد ، شامـل  ريـزوبــيـوم   Rhizobium    و وابستـگـانـش( Azorhizobium , Bradyrhizobium, Sinorhizobium) (٤) تثبيت نيتروژن را در خانواده حبوبات ياFabacea   انجام مي‌دهند (٣).

خانواده‌‌هاي ديگر گياهي نيز مي‌توانند بر همكنش بين باكتري‌هاي تثبيت كننده نیتروژن به غير از ريزوبيوم داشته باشند. اعضاء هشت خانواده گياهي كه به عنوان گياهان Actinorhizal شناخته مي‌شوند، به وسيله  .Frankia SPP  از Actinomyceteها گره‌دار مي‌شوند.

عـلفـيان مخـتـلف مثل نيـشـكر  ( Saccharum Officinarum )‏،  ذرت (Zea Mays) و برنج (Oryza Sativa) جهت تثبيت نیتروژن رابطه همزيستي با باكتري‌هاي Glucoacetobacter, Azospirillum, Herbaspirillum , Azoarcus برقرار‌مي‌كنند(٣). Anabaena در سرخس كوچك كوچك آبزي آزولا تثبيت نيتروژن را انجام مي‌دهد. (٧).

باكتري‌هاي Frankia و Rhizobium با ايجاد يك ارگان جديد به نام گروهك يا Nodule در ريشه گياه  به تثبيت نيتروژن مي‌پردازند. كه به اين‌ها مشاركت یا Association گفته مي‌شود. اما تعدادي از پاسخ‌هاي مثبت به ريشه گياه به اصطلاح برهمكنش‌هاي تثبيت نيتروژن N مبني بر مشاركت يا "associative" است كه دليل آن توليد فيتوهومون‌هاست. در اين گونه از مشاركت‌ها كه توسط باكتري‌هاي Herbaspirillum, Azospirillum, Glucoacetobacter, Azoarcus صورت مي‌گيرد، گره ايجاد نمي‌شود و باكتري N2 را جذب كرده‏، تثبيت مي‌كند و به گياه انتقال مي‌دهد (٣).



انواع گرهک 
گرهك‌ها انواع مختلفي دارند. فرم يا شكل گرهك‌ها به وسيله گياه تعيين مي‌شود و باكتري نقشي در اين مورد ندارد. اولين فرم عمده گرهك‌ها فرم نامعلوم يا Indeterminate يا Meristematic يا Cylindrical است كه در يونجه، شبدر و نخود فرنگي ديده مي‌شود.

دومين فرم عمده، شكل معلوم يا determinate يا گرهك‌هاي كروي يا Spherical مي‌باشد، كه در گياهان سويا، لوبيا و Lotus تشكيل مي‌شود(٤).

آنزيم نيتروژناز
در ميكرو ارگانيزم‌ها چه انواع همزيست و چه انواع غيرهمزيست‏، تثبيت نيتروژن به وسيله آنزيم نيتروژناز طبق واكنش زير صورت مي‌گيرد:

N2+8H++16MgATP+8e    2NH3+H2+16MGADP+16Pi

نيتروژناز به فرم‌هاي موليبدنيومي، واناديومي و آهني مي‌باشد. نيتروژناز موليبدنيومي يك آنزيم دو بخشي است. بخش كوچكتر، Fe پروتئين می باشد كه يك هومودايمر با وزن 60KDa است و بخش بزرگتر MoFe پروتئين است كه يك هتروتترامر با زيرواحدهاي α2β2 مي‌باشد. وزن اين زيرواحد 230KDa است (٥).
اين آنزيم شديداَ به اكسيژن حساس بوده و غير فعال مي‌شود. در باكتري‌هايي كه به صورت همزيست تثبيت را انجام مي‌دهند‏، القاي ژنهاي گياهي در گرهك تخصصي، لگ هموگلوبين‌ها را رمز مي‌كند. كه اين كار هـمراه با رشـد گرهك نيز مي‌باشد. لگ هموگلوبين‌ها با غلظت هاي ميلي مولار در سيتوپلاسم سلول‌هاي گياهي آلوده قبل از تثبيت نيتروژن جمع مي‌شود و در برابر اكسيژن آزاد در رنج نانومولار مقاومت مي‌كنند(٦). اما باکتری های غیر همزیست هم استراتژی هایی جهت مقابله با این مشکل دارند . بـعـضی از آنـها تنـها در شرایط بی هـوازی تثـبیت را انجام می دهند . برخی دیگر با افزایش تنفس ، محیط  را در حالت میکرو اکسیژن قرار می دهند . در جـلبک های سـبز آبی در میان سـلول های رویشی ، سلول های ویژه ای قرار دارد که فـاقـد فـتوسیستم II می باشد ، بـنابراین اکسـیژن تولید نمی شود.


همزيستي بين ريزبيوم / لگوم

ريزوبيوم:
 ريزوبيوم ها باكتري‌هاي ميله‌اي گرم منفي هستند كه سبب ايجاد گرهك برروي ريشه و (گاهي ساقه) در گياه ميزبان مي‌شوند. اين باكتري جهت تثبيت نيتروژن يك endosymbiont است. گره سازي به وسيله ريزوبيوم به يك تاكسون گياهي‎‏؛ Fabaceae محدود شده است(٤). بعضي از ريزوبيوم‌ها بسيار اختصاصي عمل كرده و فقط در چند جنس محدود همزيستي ايجاد مي‌كنند. براي مثال Sinorhizobium Meliloti تنها در گونه‌هاي جنس‌هاي يونجه (Medicago)‏، يونجه زرد( Melilotus) و Trigonella گره ايجاد مي‌كند و باكتري Rhizobum leguminosarum در جنس‌هاي نخودفرنگي (Pisum) ، عدس (Lens) و Lathyrus همزيستي ايجاد مي‌كند.

اما تمام مشاركت‌هاي ريزوبيوم /لگوم به اين سفت و سختي نيست. به طور مثال ريزوبيوم نژاد NGR234، مي‌تواند 232 گونه از 112 جنس لگوم‌ها را گره‌دار بكند. علاوه بر اين يك جنس غير لگوم به نام Parasponia andersonii از اعضاي خانواده نارون را هم گره‌دار مي‌كند (3).

لگوم:
لگوم‌ها ٣ زيرخانواده به نام‌هاي Caesalpinoid (گل ارغوان يا ابريشم)،‌ Mimosoideae (گل حساس) و Papilionoideae يا Faboideae يا (حبوبات یا پروانه آساها ) دارند. اعضاي يك زيرخانواده اصلي يعني زيرخانواده گل ارغوان در اغلب موارد گره‌دار نمي‌شود. بنابراين تشكيل گره و در نتيجه تثبيت نيتروژن به طور ١٠٠درصد با خانواده لگوم، لازم وملزوم نشده است. تشكيل گره در خانواده Fabaceae  چندين منشاء دارد. يكبار تنها در زيرخانواده گل ارغوان در جنس Chamaecrista، يكبار در Mimosoideae و يكبار هم در Faboideae.

به طور متغير، اين يك ايجاد گره براساس منشاء منفرد با كاهش چندتايي است. در هر نمونه بيش از 90 درصد Papilionoideae و Mimosoideae گره‌دار شدند، در حالي كه كمتر از ٢٥ در صدCaesalPinoideae گرهك دارند(٣).

چگونه ريزوبيوم‌ها ميزبان خود را شناخته و ارتباط برقرار مي‌كنند؟
مراحل اوليه اين فرآيند شامل بيان ژن در باكتري و رشد سلولي‏، تقسيم و تمايز در ميزبان به واسطه تبادل سيگنال بين ميزبان يوكاريوتي و همزيست كننده پروكاريوتي است. گياه سيگنال‌هايي از جنس فلاونوئيدها توليد مي‌كند. بيان ژن در باكتري القاء مي‌شود. باكتري به صورت متوالي سيگنالي سنتز مي‌كند كه گرهك زودرس در ريشه ايجاد مي‌شود. مشخصه گره‌هاي زودرس رشد تخصصي و پيچيده آنهاست. فرآيندهاي رشد در گياه شامل تغييرات ساختماني در سطح سلول و اندام (براي مثال ريخت‌زايي ريشه‌هاي مويين‏، بزرگ شدن سلول پوستي) تمايز سلول‌هاي دروني كه شامل فعال سازي سيتوپلاسم، تقسيم سلولي و بيان ژنهاي جديد مي‌باشد (٤). كه به تفصيل توضيح داده‌خواهد‌شد.



فلاوونوئيدها:
بيش از 4000 فلاوونوئيد مختلف در گياهان آوندي وجوددارد و بخشي از آنها در ميزبان‌هاي اختصاصي لگوم مي‌باشند. تمام فلاوونوئيدها شامل دو حلقه بنزني هستند كه بين شان يك حلقه هتروسيكليك Pyran يا Pyron وجوددارد. جايگاه‌هاي اختصاصي در حلقه توليد Flavonols، Flavones، Flavanones و همچنين Iso flavonoid ها را مي‌كند ( شکل 3 ). ايزوفلاوونوئيدها به خانواده لگوم محدود شده‌اند و همچنين ايزوفلاوونوئيدي كه توسط گياه سويا توليد مي‌شود،‌ باعث القاء ژن درBradyrhizobium japonicum مي‌شود. ولي همين ايزوفلاوونوئيد القاء ژن در S.meliloti را مهار مي‌كند و S.melitoti توسط Luteolin القاء مي‌شود. اين اختصاصي عمل كردن سبب مي‌شود تا ريزوبيوم‌ها ميزبان اختصاصي خود را از بين ساير لگوم‌ها تشـخـيـص بدهـند. فلاوونـوئـيدهاي اخـتصاصي تنها باعث بيان Nod gene ها نمي‌شود، بلكه سبب ايجاد يك Chemotaxis (حركت ريزوبيوم به سمت ريشه) مي‌شوند. علاوه براين به غير از ايزوفلاوونوئيدها، بيشتر فلاوونوئيدها منحصر به لگوم‌ها نيستند. چگونه ريزوبيوم‌هاي خاك ميزبان خودشان را تشخيص داده و همزيستي را آغاز مي‌كنند. درحاليكه در همانجا كه مملو از فلاوونوئيد است، ساير گياهان غير لگوم نيز حضور دارند؟

فلاوونوئيدها به عنوان يك aglycone ها سبب القاء Nodgeneها در ريزوبيوم‌ها مي‌شوند. اين كار را به وسيله ايجاد بر هـمكنـش بين محـصولات ژني nodD (تنظيم كننده 1ysR-type) انجام مي‌دهد. اين برهمكنش سبب ايجاد تغييرات ساختماني در پروتئين nodD مي‌شود كه به عنصرهاي nod box در پروموتورهاي nodgene مي‌شود. بيان دسته جمعي اين ژنها، سبب سنتز مولكول‌هاي Nod factor مي‌شودكه يك lipochitooligosaccharid است و معمولاَ شامل 4 يا ٥ N- اسـتيل گلوكز آمين‏، ٤-١- β پيوندي با انتهاي قـندي N-acylat همراه با يك اسيد چرب با زنجيره 16-18 كربني است. Nod فاكتورها مي توانند توسط استات، سولفات و يا گروه‌هاي carbamoyl تغير بكند. یا به وسيله قندهايي مثل Ara، Man، FUC‏، يا جانشينی FUC متفاوت مي‌شوند. درجه اشباع انتهاي اسيل مي‌تواند تغير بكند. اين جانشيني‌ها سبب ايجاد Nod فاكتورهاي اختصاصي مي‌شود كه توسط لگوم‌هاي مخصوص شناخته مي‌شوند. رسپتورهاي Nod فاكتورها در لگوم‌ها هنوز شناخته نشده‌است (٣).


يك مدل از آلودگي Medicago spp. به وسيله Rhizobium meliloti
 
 Nod فاكتورها به وسيله ريزوبيوم ترشح مي‌شوند پيرو آن يك سلسله از تغييرات در سطح ريشه رخ مي‌دهد كه شامل تغير كلسيم، ‍pHسيتوزولي، دپلاريزه شدن غشاء سلولي و دپليمريزه شدن ميكروفيلامنت‌ها و همچنین القاء ژنهاي گرهي مي‌باشد. طبق شکل 4 دايره محيطيه اولين بافتي است كه سيتو اسكلت ميكروتوبولي‌اش نوآرايي مي‌شود (no.1). سپس فعاليت سلولي در پوست داخلي رخ مي‌دهد كه سلول‌ها تقسيم شده و پريمورديوم آغازي حاصل مي‌شود (no.2) كمي بعد در ريشه‌هاي مويين (no.3) كه سلول‌هاي هدف براي سرايت هستند، و در سلول‌هاي كورتكس خارجي (no.3') كه در مكاني دورتر از منطقه فعاليت ريشه واقع شده‌اند، تقسيم صورت مي‌گيرد. سپس فعال سازي سلول‌ها به سمت كورتكس مياني و خارجي براساس دو شيب متقابل از تمايز سلولي رخ مي‌دهد: ١- شيب بروني (فلش‌هاي تيره) از پريمورديوم گرهي به سمت كورتكس مياني (no.4) ٢- شيب دروني (فلش روشن) از كورتكس خارجي شروع شده و در نهايت سبب تمايز سلول‌هاي PIT (no.5) مي شود. مقارن با تمايز سلولهاي PIT،‌ ريشه‌هاي مويين حلقه مي‌شوند (no.6). رشته‌هاي سرايت از ريشه‌هاي مويين حلقوي وارد مي شوند (no.7) از ميان سلول‌هاي PIT پوستي مايل به مركز رشد كرده و تا پريمورديوم‌هاي آغازي (no.8) پايين مي‌آيند. در اين مرحله پريمورديوم‌هاي مياني كه رشته‌هاي سرايت از آنها عبور نكرده به شكل مریستم‌هاي گرهي تمايز مي‌يابند و در يك مكاني دورتر از بخش ريشه كه شبكه‌هاي سرايت در آن وجود دارد (no.9) (در ساختارهاي فضايي مشابه مثل تثبيت نيتروژن در گرهكهاي نامشخص) رشد مي‌كنند. بعد از شكل‌گيري مرسيتم، فعال سازي سلول به طور تصاعدي كم شده و گرهك در سطح ريشه پديدار مي‌شود (no.10).

براي شكل‌گيري رشته‌هاي سرايت يك ارتباط بين سطح سلول‌هاي ريزوبيومي و ديواره سلولي گياه برقرار مي‌شود. گياه ميزبان lectin ترشح مي‌كند و تغييراتي در كربوهيدراتهاي اختصاصي مي‌گذارد. لكتين گياه سويا (SBA يا SBL)،‌يك گالاكتوز آمين باند شده با پروتئين است و با لكتين نخودفرنگي (PSL يا PSA) كه يك G1C/Man باند شده با پروتئين است متفاوت است. و هر دوي اين‌ها با لكتين‌هاي ساير لگوم‌ها تفاوت دارند (٣).

 نقش قارچ Arbuscular mycorrizall بر عملكرد همزيستي لگوم
خانواده لگوم سومين خانواده نهاندانگان است و جنس‌هاي مهمي مثل ذرت، ‌سويا، ‌شبدر، يونجه و ... را شامل مي‌شود. دانشمندان همواره دنبال راهكارهايي بوده‌اند كه محصـولات كـشـاورزي بيـشـتري توليد كـنـند . اسـتـفاده از آفت‌كش‌ها و كودهای ‌شيميايي اين خواسته را برآورده مي‌كند، ولي اثرات نامطلوبي بر محيط زيست دارد. در كشورهاي توسعه يافته تلقيح دانه حبوبات با. Rhizobium spp يك روش خوب و معمول است. ميكروبيولوژيست‌هاي خاك به سمت يافتن ساير ميكروارگانيزم‌هاي مفيد براي توليدات كشاورزي هستند.

ريشه‌هاي بسياري از گونه‌هاي گياهي به صورت طبيعي با قارچ آرباسكولار مايكوريزا (AMF) كه در همه خاكها حضور دارند زندگي مي‌كنند. اين قارچ به طور مستقيم نيتروژن معدني را از خاك جذب مي‌كند و آن را به گياه ميزبان انتقال مي‌دهد(١).

گرهك‌هاي زيادي با هردوي ريزوبيوم و قارچ مايكوريزاآرباسكولار همزيستي مي‌كنند. تلقيح دوگانه با هردو ميكرو ارگانيزم سبب ايجاد يك همزيستي متقابل (Mulualistis) می شود که  در نتيجه آن افزايش رشد گياه بيشتر از زماني كه با يكي از آن دو باشد، مي‌شود.

هيچ شاهدي مبني بر اين كه دو سبب افزايش اكتساب P به وسيله گياه ميزبان بشود، وجود ندارد. تصور مي‌شود كه فلاوونوئيدها كليد تركيبات سيگنالي در اين نوع همزيستي هستند.Antunes et al. گزارش داد كه وجود دو همزيست با تجمع فلاوونوئيدها را در ريشه‌‌هاي سويا تغيير داد. علاوه بر اين ميزان daidzein در ريشه، زماني كه Glomus Clarum وجود دارد، كم مي‌شود. درحالي كه genistein و Coumestrol زماني که گياه سويا با هردوي G.clarum و Bradyrhizobium japonicum تلقيح شود، كاهش مي‌يابد. Goss و devarennes بر همكنش بين سويا با B.japonicum و AMF بومي را مطالعه كردند. آنها قبل از اينكه بذر سويا را بپاشند، پتانسيل‌هاي تلقيحي متفاوتي از AMF بر روي گياه ذرت Zea mays در خاك الك شده و Undisturbed توليد كردند. گياهان سويايي كه بر روي خاك Undisturbed رشد كردند، خيلي سريع‌تر رشد كردند و بيوماس بيشتري نسبت به خاك disturbed جمع شد. علاوه براين، يك بر همكنش مثبت بين دو همزيست ميكروبي ايجاد مي‌شود كه در نتيجه آن كلوني بسيار فراواني بر روي ريشه به وسيله دو ميكروب ايجاد مي‌شود. استقرار آرباسكولار وزيكولاز در خاكUndisturbed  بيشتر از خاك الك شده مي‌باشد. وزن گرهك و ميزان نيتروژن دريافت كرده از اتمسفر در خاك Undisturbed بيشتر ا ز خاکdisturbed   مي‌باشد. اين مطالعه پيشنهاد داد كه برهمكنش مثبت بين ريزوبيا، AMF و گرهك، در خاكهاي Undisturbed باعث تنظيم استقرار AMF بر ريشه مي‌شود. درحاليكه خاكهاي disturbed در استقرار AMF بر روي ريشه تأخير مي‌اندازند.

نتايج مطالعات Goss and de varennes استفاده از تلقيح دوگانه را برروي ساير جنس‌هاي گياهي و ميكروبي تأييد نمي‌كند. اين‌ها از خاك گلداني لجني از كانادا تحت شرايطي با دماي پايين در زمستان (پوشيده شده با برف در مدت چندين ماه) و تابستانهاي گرم و مرطوب استفاده كردند. خاكي كه در آزمايش حاضر استفاده شد، خاك رس از پرتغال با آب و هواي مديترانه‌اي با زمستان مرطوب و معتدل (بدون برف) و تابستان‌هاي گرم وخشك است. به علاوه در آزمايش حاضر، خاك به وسيله P غني شده بود و اين كار شرايط را به حالت ميداني نزديكتر كرد. درحاليكه آنها هيچ كودي اضافه نكرده بودند.در تيمارهاي اول هيچ پاسخي مشاهده نشده بود. P قابل دسترس درخاك رشد گندم را محدود نمي‌كند (٩).


 تأثيرات مثبت و منفي تلقيح با كرم خاكي و AMF
AMF توانايي Laucaena را در تثبيت نیتروژن در گرهك‌ها و وضعيت تغذيه‌اي گياه را بهبود مي‌بخشد و يك نقش دفاعي بر علیه فلزهاي سمي دارد.كرم‌هاي خاكي بر پراكنش بهبود شرايط رشد به گياه كمك مي‌كنند.

تأثير مشاركت AMF و كرم‌هاي خاكي، در رشد گياه، تغذيه (بهبود جذب N، P و K) است و همچنين حفاظت در برابر فلزهاي سمي مي‌باشد. اما كرم‌هاي خاكي تأثيرات سودمند AMF را در تثبيت نيتروژن مهار مي‌كنند. ( جدول 1 )